Phospho-POLR2A CTD-T4 Kaninchen-Polyclonaler Antikörper für WB, IP, ELISA, ChIP – P24928

Kernproduktspezifikationen und Parameter

Biologischer Hintergrund: Funktion und Lokalisation von POLR2A

• POLR2A codiert die größte Untereinheit der RNA-Polymerase II (Pol II), ein ~217 kDa großes Protein, das als katalytisches Kernstück für die DNA-abhängige RNA-Synthese dient – essenziell für die Herstellung von mRNA und nicht-codierender RNA. Verwandte Referenzen: PMID:23748380, PMID:27193682, PMID:30190596
• Die C-terminale Domäne (CTD) von POLR2A besteht aus 52 tandemartigen Heptapeptid-Wiederholungen (YSPTSPS), die dynamisch phosphoryliert werden – hauptsächlich an Ser2 und Ser5 – um Transkriptionsinitiation, -elongation und -termination sowie die kotranskriptionelle RNA-Prozessierung zu regulieren. Verwandte Referenzen: PMID:24207025, PMID:26124092
• POLR2A besitzt ein DxDGD-Motiv, das Mg2+-Ionen koordiniert, die für die Nukleotidaddition essenziell sind, und weist zudem eine 3'-5'-Exonukleaseaktivität zur Korrekturlesung auf, die eine hohe Transkriptionsgenauigkeit gewährleistet. Verwandte Referenzen: PMID:8381534, PMID:9852112
• POLR2A ist hauptsächlich im Zellkern und auf Chromosomen lokalisiert, wurde aber auch im Zytoplasma nachgewiesen – dies spiegelt sein dynamisches Shuttling und seine vielseitigen Funktionen wider.
• Posttranslationale Modifikationen wie Serin/Threonin-Phosphorylierung, Lysin-Acetylierung, Methylierung und Ubiquitinierung modulieren die Aktivität und Stabilität der Pol II.
• Durch alternatives Spleißen entstehen mehrere Isoforme, Mutationen in POLR2A sind mit entwicklungsneurologischen Störungen verbunden – dies unterstreicht seine klinische Bedeutung.
• Es fungiert zudem als RNA-abhängige RNA-Polymerase, die nicht-codierende RNAs verlängert, und wirkt als Replikase für das Hepatitis-Delta-Virus während der Infektion.

Experimentelle Anleitung und Technische Hinweise

• Da das Immunogen ein phosphospezifisches Peptid ist, das T4 der POLR2A-CTD-Wiederholungen entspricht, validieren Sie die Antikörperspezifität durch Wettbewerb mit nicht phosphoryliertem Peptid oder mit Phosphatase-behandeltem Zelllysat, um die Phospho-Abhängigkeit zu bestätigen.
• Für das Western Blotting (WB) verwenden Sie aufgrund der großen Proteingröße (~217 kDa) am besten SDS-PAGE-Gele mit niedrigem Prozentsatz (z. B. 6–8 %) und verlängerte Transferzeiten, um einen effizienten Transfer von volllängen POLR2A zu gewährleisten.
• Für die ChIP-Anwendung kann eine Optimierung der Quervernetzungs- und Chromatin-Schervorgänge erforderlich sein; testen Sie verschiedene Scherverfahren (z. B. Sonikation oder enzymatische Verdauung), um Chromatinfragmente von 200–500 bp zu erhalten.
• In Immunpräzipitations (IP)- und ELISA-Experimenten verwenden Sie geeignete Positiv- und Negativkontrollen, wie Lysate bekannter POLR2A-exprimierenden Zelllinien (z. B. HeLa, HEK293) und falls verfügbar phosphodefiziente Mutanten.

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