PE Kaninchen anti-Human/Maus Phospho-Zap70-Y319+Syk-Y352 monoklonaler Antikörper für intrazelluläre Durchflusszytometrie - P43403

Kernproduktspezifikationen und -parameter

Biologischer Hintergrund: ZAP70-Funktion und -Lokalisierung

• ZAP70 ist eine 70 kDa Tyrosinkinase, die für die adaptive Immunität essentiell ist und eine zentrale Rolle in der T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Signalgebung spielt, indem sie nach Aktivierung die Adapterproteine LAT und LCP2 phosphoryliert.
• Nach der TCR-Engagement wird ZAP70 zu den phosphorylierten ITAM-Motiven von CD3E und CD247/CD3Z an der Plasmamembran rekrutiert, ein Prozess, der ihre Autoinhibition lindert und eine LCK-vermittelte Phosphorylierung erfordert (PubMed:7509083).
  Verwandte Referenzen: PMID:7509083
• ZAP70 reguliert weiter die Dynamik der T-Zell-Aktivierung durch Kontrolle der Zytoskelett-Reorganisation, Adhäsion und Mobilität und gewährleistet so eine ordnungsgemäße Effektorabgabe an antigenpräsentierende Zellen.
• Sie ist auch an der TCR-Downregulation beteiligt, indem sie die Internalisierung und den Abbau von CD247/CD3Z durch Interaktion mit dem Ubiquitin-Ligasen CBL und den Adaptoren SLA/SLA2 vermittelt und so die Signalbeendigung moduliert.
• ZAP70 wird in T-Zellen, natürlichen Killerzellen, frühen Thymozyten und pro/prä B-Zellen exprimiert und trägt zur Entwicklung und Aktivierung sowohl von T-Zellen als auch von B-Zellen bei.
• Das Protein enthält zwei SH2-Domänen, die spezifisch an phosphorylierte ITAMs binden, eine ATP-bindende Kinasedomäne und unterliegt posttranslationalen Modifikationen einschließlich Phosphorylierung, Acetylierung und Ubiquitinierung, wie durch UniProt-Schlüsselwörter wie „Phosphoprotein“, „Ubl-Konjugation“, „Isopeptidbindung“ und „Acetylierung“ hervorgehoben wird.
• Durch alternatives Spleißen entstehen mehrere Isoformen von ZAP70, und krankheitsassoziierte Varianten sind mit einer schweren kombinierten Immundefizienz (SCID) aufgrund einer beeinträchtigten TCR-Signalgebung verbunden.
• Die Immunogenstelle (Y319) ist eine wichtige regulatorische Phosphorylierungsstelle in der Interdomäne B, die über Mensch und Maus hinweg hochkonserviert ist; ihre Phosphorylierung ist kritisch für die ZAP70-Aktivierung. Der Antikörper kann aufgrund der Sequenzhomologie in der Aktivierungsschleife auch kreuzreaktiv mit Syk an dessen analoger Y352-Stelle sein.

Experimentelle Anleitung und technische Tipps

• Wegen der phosphospezifischen Natur dieses Antikörpers sollten Phosphatase-Inhibitoren in allen Lyse-, Fixierungs- und Färbe-Puffern enthalten sein, um die Phosphorylierungsniveaus während der Probenaufbereitung aufrechtzuerhalten.
• Validieren Sie die Antikörperspezifität durch Vergleich von Signalen in stimulierten vs. unstimulierten Zellen oder durch Behandlung der Proben mit Lambda-Phosphatase vor der Färbung.
• Der Antikörper ist für die intrazelluläre Durchflusszytometrie (FC intra) validiert; stellen Sie optimierte Fixierungs- und Permeabilisierungsprotokolle (z. B. Verwendung von Methanol oder Saponin-basierter Permeabilisierung) für beste Ergebnisse sicher.
• Für Studien zur T-Zell-Signalgebung sollten Sie bekannte positive Kontrollen wie anti-CD3/CD28-stimulierte Jurkat-Zellen oder primäre humane PBMCs und negative Kontrollen wie ruhende T-Zellen oder Syk-defiziente B-Zellen zur Bewertung der Kreuzreaktivität in Betracht ziehen.

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