Anti-Phospho-NF-κB p65/RelA-S311 Kaninchen pAb für WB, ELISA - Q04206

Kernproduktspezifikationen und Parameter

Biologischer Hintergrund: Funktion und Lokalisation des Transkriptionsfaktors p65

• NF-kappa-B ist ein pleiotroper Transkriptionsfaktor, der in fast allen Zelltypen vorkommt und als Endpunkt verschiedener Signaltransduktionskaskaden fungiert. Er bildet Homo- oder Heterodimere; der heterodimere RELA-NFKB1-Komplex ist am häufigsten und wirkt als transkriptioneller Aktivator.
• RELA (p65) bindet an Kappa-B-Stellen in Promotoren von Zielgenen mit einer unterschiedlichen dimerspezifischen Affinität und Spezifität, aktiviert die Transkription direkt und moduliert indirekt die Chromatinzugänglichkeit für andere Faktoren.
• In nicht stimulierten Zellen bleiben NF-kappa-B-Komplexe im Zytoplasma durch I-kappa-B-Inhibitoren inaktiv gehalten. Nach Stimulation wird I-kappa-B durch IKKs phosphoryliert und abgebaut, wodurch RELA freigesetzt wird, das in den Zellkern wandert und die Genexpression initiiert.
• RELA unterliegt umfangreichen posttranslationalen Modifikationen – einschließlich Phosphorylierung an mehreren Stellen (z. B. S311), Acetylierung, Methylierung und Ubiquitinierung – die seine Aktivität, Stabilität und Proteininteraktionen regulieren.
• Essenziell für die Zytokin-Genexpression in T-Zellen, was seine kritische Rolle bei adaptiven Immunantworten unterstreicht.
  Verwandte Referenzen: PMID:15790681
• Identifiziert als Schlüsseltranskriptionsfaktor, der die Interferonantwort während einer SARS-CoV-2-Infektion steuert. Verwandte Referenzen: PMID:33440148
• Die subzelluläre Lokalisation ist unter Ruhebedingungen hauptsächlich zytoplasmatisch, da I-kappa-B das Kernlokalisierungssignal maskiert; nach Aktivierung erfolgt eine rasche Akkumulation im Zellkern.
• Annotiert mit Schlüsselwörtern wie Phosphoprotein, Acetylierung, Methylierung, Ubl-Konjugation, Isopeptidbindung und S-Nitrosylierung, was das komplexe regulatorische Netzwerk widerspiegelt, das diesen Master-Transkriptionsfaktor steuert.

Experimentelle Anleitung und Technische Tipps

• Das Immunogen, ein synthetisches Phosphopeptid, das S311 umfasst, wurde entwickelt, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch für die phosphorylierte Form sind. Überprüfen Sie die Phosphospezifität, indem Sie Lysate vor der WB mit Lambda-Phosphatase behandeln.
• Geeignete Anwendungen gemäß Lieferant: WB und ELISA. Für die Western Blot verwenden Sie 20–30 µg Ganzzelllysat und einen Standard-Blockingpuffer; validieren Sie die Bandengröße um 60 kDa mit geeigneten Positivkontrollen (z. B. mit TNF-α stimulierte HeLa-Zellen).
• Für ELISA erwägen Sie die Beschichtung mit dem Phosphopeptid und verwenden Sie dessen nicht phosphoryliertes Gegenstück als Negativkontrolle, um die ortsspezifische Bindung zu bestätigen.
• Kreuzreaktiv mit Mensch und Maus; führen Sie eine erste Validierung in relevanten Zelllinien oder Geweben dieser Spezies durch. Es wird empfohlen, die NF-κB-Signaltransduktion mit Stimuli wie TNF-α oder PMA/Ionomycin zu induzieren, um die Phosphorylierungssignale zu verstärken.
• Vermeiden Sie aggressives Stripping der Membran, das den Phosphorylierungsstatus verändern kann; verwenden Sie stattdessen Puffer mit niedrigem pH-Wert oder milden Detergenzien, wenn ein erneutes Sonden erforderlich ist.

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