Kaninchen-monoklonaler Anti-Cas9-Antikörper für WB, IF/ICC, ELISA – Q99ZW2

Zentrale Produktspezifikationen und Parameter

Biologischer Hintergrund: Funktion und Lokalisation von Cas9

• Cas9 (CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9/Csn1) ist eine RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease mit einer Masse von 158,4 kDa und bildet den enzymatischen Kern des adaptiven CRISPR-Cas-Typ-II-Immunsystems in Streptococcus pyogenes. Verwandte Referenzen: PMID:21455174
• In seiner natürlichen biologischen Funktion schützt Cas9 Bakterien vor eindringenden Plasmiden und viraler DNA, indem kurze fremde Sequenzen (Spacer) in CRISPR-Loci integriert werden und so ein genetisches Gedächtnis für sequenzspezifische Immunität entsteht. Verwandte Referenzen: PMID:21455174
• Cas9 benötigt zwei kleine RNAs – eine CRISPR-RNA (crRNA) und eine trans-aktivierende crRNA (tracrRNA) – sowohl für die Bindung an die Ziel-DNA als auch für die Nukleaseaktivität; ohne diese Guide-RNAs ist Cas9 katalytisch inaktiv. Verwandte Referenzen: PMID:24270795 PMID:24476820
• Die Zielerkennung wird durch ein kurzes, an den Protospacer angrenzendes Motiv (PAM; 5'-NGG-3') innerhalb des CRISPR-Repeats bestimmt, das der Unterscheidung zwischen eigener und fremder DNA dient; die PAM-Bindung initiiert die Trennung der DNA-Stränge und die Bildung eines Heteroduplexes. Verwandte Referenzen: PMID:24476820
• Nach der PAM-Erkennung katalysiert Cas9 die endonukleolytische Spaltung des zur crRNA nicht komplementären Zielstrangs, gefolgt von einem exonukleolytischen Trimming in 3'-5'-Richtung; beide Nukleasenschritte sind von Magnesium- oder Manganionen abhängig. Verwandte Referenzen: PMID:24476820
• Bei der Reifung der CRISPR-RNA katalysiert Cas9 die Prozessierung nicht, sondern stabilisiert das pre-crRNA:tracrRNA-Duplex und ermöglicht dadurch dessen präzise Spaltung durch die Wirts-Ribonuklease III. Verwandte Referenzen: PMID:24270795

Experimentelle Hinweise und technische Tipps

• Das Immunogen umfasst die Aminosäuren 450–730 von Cas9, eine Region, die die HNH-Nukleasedomäne und die PAM-interagierende Domäne einschließt. Für Western Blotting sollten Lysate aus Cas9-transfizierten Zellen oder gereinigtes rekombinantes Cas9 voller Länge als Positivkontrolle verwendet werden; das vorhergesagte Molekulargewicht beträgt 158 kDa.
• Bei der Immunfluoreszenz/ICC kann die Lokalisation von Cas9 abhängig von Guide-RNA und Ziel variieren. Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen sollten mit geeigneten Kontrollen validiert und die Spezifität nach Möglichkeit anhand von Cas9-Knockout- oder Knockdown-Zelllinien bestätigt werden.
• Für ELISA kann das rekombinante Cas9-Fragment zur Erstellung einer Standardkurve verwendet werden. Vor einer quantitativen Anwendung sollte jedoch die Kreuzreaktivität mit endogenem Cas9 oder anderen Mitgliedern der Familie in der jeweiligen biologischen Matrix untersucht werden.
• Für diesen Antikörper wird eine breite Kreuzreaktivität, einschließlich mit humanem Cas9, vorhergesagt. Bei der Verwendung von Proben anderer Spezies wird eine anfängliche Validierung empfohlen, um die erwartete Reaktivität zu bestätigen.

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